In-edit ni Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, naaprubahan noong Disyembre 25, 2020 (na-review noong Oktubre 25, 2020)
Iniuulat namin ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga subunit sa pag-replika ng mga coronaviruses-transcription complex, na mahalaga para sa pagtitiklop at pag-iingat ng ebolusyon.Nagbigay kami ng katibayan na ang domain ng NiRAN na nauugnay sa nsp12 ay may aktibidad na nucleoside monophosphate (NMP) transferase sa trans, at kinilala ang nsp9 (isang RNA na nagbubuklod na protina) bilang target nito.NiRAN catalyzes ang covalent attachment ng NMP moiety sa conserved nsp9 amino terminus sa isang reaksyon na umaasa sa Mn2+ ions at katabing conserved Asn residues.Napag-alaman na ang aktibidad ng NiRAN at nsp9 NMPylation ay mahalaga para sa pagtitiklop ng coronavirus.Ang data ay nagbibigay-daan sa amin na i-link ang aktibidad na ito ng nested virus enzyme marker sa mga nakaraang obserbasyon sa hypothesis na ang pagsisimula ng RNA synthesis sa isang klase ng mga RNA virus ay functional at evolutionarily consistent.
Ang RNA-dependent na RNA polymerase (RdRps) ng Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, at 12 iba pang pamilya) ay naka-link sa amino-terminal (N-terminal) domain sa non-structural protein (nsp) na inilabas mula sa polyprotein, na tinatawag na NiRAN Ang 1ab ay binubuo ng viral main protease (Mpro).Noong nakaraan, ang arterial virus na NiRAN-RdRp nsp na sariling aktibidad ng GMPylation/UMPylation ay naiulat, at iminungkahi na makabuo ng isang lumilipas para sa paglipat ng nucleoside monophosphate (NMP) sa (kasalukuyang hindi alam) na virus at/o cell biopolymerization Things.Dito, ipinapakita namin na ang coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E at Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ay may Mn2+-dependent na NMPylation activity, na nagmula sa nsp9 sa pamamagitan ng pagbuo ng Mpro-mediated nsp9 After. ang N-terminal flanking nsps ay proteolytically na inilabas, ang phosphoramidate ay nakatali sa pangunahing amine (N3825) sa N-terminal ng nsp9.Ang uridine triphosphate ay ang ginustong nucleotide sa reaksyong ito, ngunit ang adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, at cytidine triphosphate ay angkop din sa mga co-substrate.Ang mga pag-aaral ng mutation gamit ang mga recombinant na coronavirus nsp9 at nsp12 na protina at genetically engineered na HCoV-229E mutants ay natukoy ang mga residue na kinakailangan para sa NiRAN-mediated nsp9 NMPylation at virus replication sa cell culture.Kinumpirma ng data ang hula ng mga nalalabi sa aktibong site ng NiRAN at tinukoy ang mahalagang papel ng mga nalalabi ng nsp9 N3826 sa nsp9 NMPylation at pagtitiklop ng virus sa vitro.Ang residue na ito ay bahagi ng conserved N-terminal NNE tripeptide sequence at napatunayang ang tanging invariant residue ng nsp9 at ang mga homolog nito sa pamilya ng coronavirus.Nagbibigay ang pag-aaral na ito ng matibay na pundasyon para sa functional na pag-aaral ng aktibidad ng NMPylation ng iba pang mga nested na virus at nagmumungkahi ng mga posibleng target para sa pagbuo ng mga antiviral na gamot.
Ang Nidovirales positive-stranded RNA virus ay nakakahawa sa iba't ibang vertebrates at invertebrates (1, 2).Kasalukuyang kasama sa order ang 14 na pamilya (3), kung saan ang pamilyang Coronavirus ay malawakang pinag-aralan sa nakalipas na 20 taon.Noong panahong iyon, tatlong zoonotic coronavirus ang lumabas mula sa mga host ng hayop at nagdulot ng malakihang paglaganap ng malubhang impeksyon sa paghinga sa mga tao.Kabilang ang patuloy na mga pandemya na dulot ng matinding talamak na mga nakakahawang sakit.Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Ang mga Nidovirus ay nagbabahagi ng isang karaniwang genome na organisasyon, at ang subunit ng membrane-bound replication-transcription complex (RTC) ay naka-encode sa 5-?²-terminal two-thirds at ang pangunahing structural subunit ng virus particle, pati na rin ang ilang mga accessory. .Protein, na naka-encode sa 3??² sa ikatlong dulo ng genome (1).Maliban sa isang pamilya ng mga planarian virus (Monoviridae) (8), lahat ng mga nested na virus ay nag-encode ng mga RTC subunits sa dalawang malalaking open reading frame (ORF) ORF1a at ORF1b, na isinalin mula sa genomic RNA ng.Ang ORF1a ay nag-encode ng polyprotein (pp) 1a, at ang ORF1a at ORF1b ay magkasamang nag-encode ng pp1ab.Sa pangkalahatang paglahok ng pangunahing protease (Mpro) na naka-encode ng ORF1a, ang parehong pp1a at pp1ab ay proteolytically na pinoproseso sa iba't ibang non-structural proteins (nsps), na kilala rin bilang 3CLpro, dahil mayroon itong homology sa 3Cpro ng picornavirus ( 9).Ang mga nsps na ito ay naisip na tipunin sa isang malaking dynamic na RTC, catalyze ang synthesis ng genomic RNA (replication) at isang set ng subgenomic RNA (transcription), at ginagamit upang i-coordinate ang expression ng ORF na matatagpuan sa ibaba ng agos ng ORF1b (10? ? ?12).
Kasama sa core RTC ang RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) at ilang RNA processing enzymes, na pangunahing naka-encode sa ORF1b at sa coronavirus family Naglalaman ito ng nsp12-nsp16 at nsp9-nsp12 sa pamilyang Arterioviridae (tingnan ang sanggunian 10ââ 12).Kinakatawan ng RdRp at HEL1 ang dalawa (isang-ikalima) na conserved domain ng bird's nest virus at may homology sa iba pang RNA virus.Ang core replicase ay pinaniniwalaang tinutulungan ng iba pang mga subunit, kabilang ang ilang maliliit na nsps na inilabas mula sa carboxy-terminal (C-terminal) na rehiyon ng pp1a, sa ibaba ng Mpro (coronavirus nsp5 at arterial virus nsp4, ayon sa pagkakabanggit).Mayroon silang limitadong proteksyon na partikular sa pamilya at magkakaibang mga aktibidad (susuri sa sanggunian 10ââ12).
Kamakailan lamang, ang isang domain na may natatanging sequence motif na katangian ay natagpuan sa amino terminus (N-terminus) na katabi ng RdRp sa lahat ng mga nested na virus, ngunit walang ibang RNA virus (16).Batay sa lokasyon nito at aktibidad ng nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), ang domain na ito ay pinangalanang NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Ang dual-domain na kumbinasyon ng NiRAN-RdRp ay bumubuo ng nsp12 sa Coronaviridae family at nsp9 sa Arterioviridae family, at sa iba pang nestoviridae, ang NiRAN-RdRp ay inaasahang ilalabas bilang isang independent nsp mula sa viral polyprotein.Sa coronavirus, naglalaman ang NiRAN domain ng ??1/450 residues at nakakonekta sa C-terminal RdRp domain sa pamamagitan ng linker region (16?19).Sa Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), ipinapakita ng recombinant nsp9 ang Mn2+ ion-dependent (self) UMPylation at GMPylation na aktibidad, na nakadepende sa tatlong conserved sequence base sa nestovirus, AN, BN at CN Ang mga nalalabi sa sequence.Kung saan ang N ay nangangahulugang NiRAN) (16).Ang N-terminal flanking ng mga motif na ito ay isang hindi gaanong konserbatibong motif preAN.Ang ilan sa mga nalalabi na ito ay natipid din sa malayong nauugnay na mga kinase ng protina, kung saan ipinakita ang mga ito na kasangkot sa pagbubuklod ng nucleoside triphosphate (NTP) at aktibidad ng catalytic (20, 21).Alinsunod sa obserbasyon na ito, ang ilang pangunahing aktibong residue ng site sa pseudokinase SelO mula sa Pseudomonas syringae ay maaaring tipunin kasama ang kamakailang nai-publish na SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomplex.Nakapatong sa electron microstructure ang mga natirang nalalabi sa NiRAN ng Coronavirus.Recombinant na protina (17).Ipinapalagay na ang dokumentado (sariling) U/GMPylation ay gagawa ng isang lumilipas na estado upang ilipat ang NMP sa (kasalukuyang hindi alam) na substrate (16), at ang pagkakatulad ng istruktura sa pagitan ng NiRAN at protina kinase (17, 19) ) Ay ang hypothesis na Binabago ng NiRAN ang iba pang mga protina.
Maraming feature, kabilang ang natatangi at natatanging sistematikong kaugnayan nito sa mga nested virus at genetic separation mula sa RdRp, na ginagawang isang makatwirang key regulatory enzyme ang NiRAN para sa mga nested na virus, na kritikal sa kanilang paglitaw at pagkakakilanlan.Noong nakaraan, tinawag ang tatlong posibleng pag-andar na kinasasangkutan ng NiRAN upang i-regulate ang genome/subgenomic na pagsasalin o replikasyon/transkripsyon.Kung isasaalang-alang ang kakaunti at hindi kumpletong data na magagamit sa panahong iyon, ang bawat function ay may mga pakinabang at disadvantage nito (16).Sa pananaliksik na ito, nilalayon naming pagsamahin ang biochemical at reverse genetic na pag-aaral ng mga coronavirus na kumakatawan sa dalawang genera, at ilagay ang aming mga natuklasan sa evolutionary background ng natural na mutation ng pamilyang coronavirus, upang magkaroon ng insight sa Mahiwagang kaharian na ito.Nag-uulat kami ng mga malalaking pag-unlad sa pag-unawa sa NiRAN sa pamamagitan ng pagkilala sa mga natural na target sa RTC, na (kabilang sa tatlong magagamit na hypotheses) ay nag-aambag sa papel ng domain na ito sa pagsisimula ng synthesis ng nested virus RNA.Ang pananaliksik na ito ay nagbubukas din ng mga posibilidad para sa iba pang mga tungkulin ng NiRAN sa interface ng host ng virus.
Upang matukoy ang mga katangian ng enzymatic ng domain ng NiRAN na nauugnay sa corona virus nsp12, gumawa kami ng recombinant na anyo ng human coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 sa E. coli, na may tag na His6 sa C-terminus, at pinagsama ang protina na may [α32-P ] I-incubate kasama ang NTP sa presensya ng MnCl2 gaya ng inilarawan sa Mga Materyales at Paraan.Ang pagsusuri ng produkto ng reaksyon ay nagpahiwatig ng pagkakaroon ng isang radiolabeled na protina na co-migrating kasama ang nsp12 (106 kDa), na nagpapahiwatig na ang coronavirus nsp12 ay nagpapagana ng pagbuo ng mga covalent protein-NMP adducts, mas pinipiling nabuo sa uridine monophosphate (UMP) (Larawan 1A) At B).Ipinakita ng quantitative analysis na kumpara sa iba pang mga nucleotide, ang intensity ng signal ng pagsasama ng UMP ay tumaas ng 2 hanggang 3 beses (Larawan 1C).Ang data na ito ay pare-pareho sa hinulaang aktibidad ng NMP transferase ng NiRAN domain ng coronavirus (16), ngunit nagpapahiwatig na ang mga kagustuhan sa nucleotide ng NiRAN domain ng coronavirus at ang arterial virus ay magkaiba.
Self-NMPylation na aktibidad ng HCoV-229E nsp12.(A) Ang HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ay natupok ng itinalagang [α-32P] NTP sa pagkakaroon ng 6 mM MnCl2 sa loob ng 30 minuto (tingnan ang Mga Materyales at Paraan para sa mga detalye).Ang mga produkto ng reaksyon ay pinaghiwalay ng SDS-PAGE at nilagyan ng Coomassie brilliant blue.(B) Ang radiolabeled na protina ay nakikita sa pamamagitan ng phosphorous imaging.Ang mga posisyon ng nsp12-His6 at protina molecular mass marker (sa kilodaltons) ay ipinapakita sa A at B. (C) Ang intensity ng radioactive signal (mean ± SEM) ay natukoy mula sa tatlong independiyenteng mga eksperimento.*P≤0.05.Ang lakas ng signal (porsiyento) ay nauugnay sa UTP.
Bagama't napatunayang mahalaga ang mga aktibidad ng enzyme na nauugnay sa NiRAN para sa pagtitiklop ng EAV at SARS-CoV sa cell culture (16), hindi pa natutukoy ang partikular na function ng NiRAN at mga potensyal na target.Ang kamakailang naiulat na pagkakapareho ng istruktura sa pagitan ng NiRAN at isang pamilya ng mga protina na may mga fold na tulad ng protina kinase (17, 22) ay nag-udyok sa amin na subukan ang hypothesis na ang NiRAN ay nag-catalyze ng NMPylation ng iba pang mga protina.Nakabuo kami ng isang hanay ng mga potensyal na homologous na target, kabilang ang mga non-structural protein na naka-encode ng HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), bawat isa ay naglalaman ng C-terminal His6 tag (SI appendix, Table S1), At incubate ang mga protina na ito ng [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) sa pagkakaroon o kawalan ng nsp12.Ang bovine serum albumin at MBP-LacZα fusion protein na ginawa sa E. coli ay nagsilbing mga kontrol (Larawan 2A, mga linya 1 hanggang 7).Ang radiolabeled na protina ay sinuri ng sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) at autoradiography, at napag-alaman na mayroong malakas na radioactive signal sa reaksyon na naglalaman ng nsp12 at nsp9.Ang posisyon ng signal ay tumutugma sa molecular mass ng nsp9, na nagpapahiwatig ng nsp12-mediated UMPylation ng nsp9 (Larawan 2B, track 7).Walang iba pang mga pagsubok na protina ang natagpuan na UMPylated, na humantong sa amin upang tapusin na ang nsp9 ay isang tiyak na substrate ng nsp12.Alinsunod sa data ng self-NMPylation na ipinapakita sa Figure 1, nagagawa ng nsp12 na ilipat ang lahat ng apat na NMP sa nsp9, bagaman iba ang kahusayan, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Larawan).3 A at B).Sa ilalim ng mga kundisyong ginamit sa assay na ito (paikliin ang reaksyon at oras ng pagkakalantad, bawasan ang konsentrasyon ng nsp12; mga materyales at pamamaraan), hindi matukoy ang self-NMPylation ng nsp12 (ihambing ang Figure 2B, lane 7, at Figure 1B), na napatunayang epektibo (At maramihang pag-ikot) Ang UMP ay lumipat mula sa nsp12 hanggang sa nsp9.Ang aktibidad ng UMP transferase ay nangangailangan ng pagkakaroon ng mga Mn2+ ions, tulad ng ipinapakita sa Figure 3C, habang ang minimal na aktibidad ng UMP transferase ay naobserbahan sa pagkakaroon ng Mg2+, at walang aktibidad sa pagkakaroon ng iba pang dalawang divalent cations na nasubok.Ang magkatulad na data ay nakuha sa NMPylation assays na naglalaman ng cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), at adenosine triphosphate (ATP) (SI appendix, Figure S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation ng nsp9.Ang isang serye ng mga substrate ng protina (kabilang ang bovine serum albumin, MBP-lacZα, at isang serye ng HCoV-229E nsps na may label na C-terminal His6 na naka-encode ng ORF1a) ay ginamit upang suriin ang aktibidad ng UMPylation ng HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated protina.I-incubate ang protina gamit ang [α-32P] UTP sa loob ng 10 minuto sa kawalan (A) o presensya (B) ng nsp12 gaya ng inilarawan sa mga materyales at pamamaraan.Sa tuktok ng A at B, ipinapakita ang SDS-polyacrylamide gel na may mantsa ng Coomassie Brilliant Blue, at sa ibaba ng A at B, ipinapakita ang kaukulang autoradiograms.Ang posisyon ng protina molecular mass marker (sa kilodaltons) ay ibinibigay sa kaliwa.Ang posisyon ng nsp12-His6 (B, tuktok) at ang radioactive signal na sinusunod sa panahon ng pagpapapisa ng itlog ng nsp12-His6 na may nsp9-His6 (B, lane 7) ay ipinahiwatig din, na nagpapahiwatig na ang [α-32P]UMP sa nsp9-His6 (12.9 kDa), na hindi naobserbahan para sa iba pang mga protina na nasubok.
HCoV-229E NiRAN-mediated biochemical at virological characterization ng nsp9 NMPylation.(A at B) Ang papel ng nucleotide co-substrate na ginamit sa reaksyon.Ang Nsp12-His6 at nsp9-His6 ay halo-halong at incubated sa pagkakaroon ng iba't ibang [α-32P] NTP sa karaniwang NMPylation assay.(A, itaas) Coomassie-stained nsp9-His6 na pinaghihiwalay ng SDS-PAGE.(A, ibaba) Autoradiograph ng parehong lugar ng gel.(B) Ang kamag-anak na aktibidad (mean ± SEM) sa pagkakaroon ng itinalagang nucleotide cofactor ay tinutukoy mula sa tatlong independiyenteng mga eksperimento.*P≤0.05.(C) Ang papel ng mga metal ions.Ang ipinapakita ay ang standard na NMPylation test sa pagkakaroon ng [α-32P] UTP at iba't ibang metal ions, bawat isa ay may konsentrasyon na 1 mM.Sa C, sa itaas, ipinapakita ang Coomassie stained nsp9-His6, at sa C, sa ibaba, ipinapakita ang kaukulang autoradiography.Ang laki ng may label na protina (sa kilodaltons) ay ipinapakita sa kaliwa ng A at C. (D) Ang mutant form ng HCoV-229E nsp12-His6 na nagdadala ng tinukoy na amino acid substitution ay nasa [α-32P]UTP, gaya ng inilarawan sa Mga Materyales at Paraan.Ang radiolabeled nsp9-His6 na ginawa sa reaksyon ng NMPylation ay nakita ng phosphorylation imaging (D, tuktok).Ang kaugnay na aktibidad kumpara sa wild-type (wt) na protina ay ipinapakita sa D, at ang ibaba ay kinukuha bilang average (± SEM) mula sa tatlong Independent na eksperimento.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga pagpapalit ng mga hindi natipid na nalalabi.(E) Ang titer ng virus sa supernatant ng kultura ng mga p1 cells ay nakuha 24 na oras pagkatapos matukoy ang impeksyon sa pamamagitan ng plaque assay.Ang mga pagpapalit ng codon sa domain ng NiRAN ng engineered HCoV-229E mutant ay ipinahiwatig (ang pag-numero ng nalalabi ay batay sa kanilang posisyon sa pp1ab).Ang replication-deficient RdRp active site mutant nsp12_DD4823/4AA ay ginamit bilang isang kontrol.
Upang makakuha ng mas malalim na pag-unawa sa aktibong site ng NiRAN at matukoy ang mga nalalabi na nauugnay sa aktibidad ng nsp9-specific na NMP transferase, nagsagawa kami ng pagsusuri sa mutation, kung saan pinalitan namin ang mga konserbatibong nalalabi sa mga motif ng NiRAN AN, BN at CN ( 16) Ito ay Ala (SI appendix, Figure S2).Bilang karagdagan, ang epekto ng konserbatibong Arg-to-Lys o Lys-to-Arg na mga pagpapalit ay nasuri sa dalawang kaso.Bilang isang (negatibong) kontrol, ang mga nalalabi na hindi o hindi gaanong natipid sa NiRAN domain ng mga coronavirus at iba pang mga nested na virus ay pinapalitan ng Ala. Pinapalitan ang K4116A (sa motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif Ang BN) at D4280A (CN) ay makabuluhang binabawasan o tinatanggal ang nsp9 NMPylation sa pamamagitan ng nsp12, habang ang mga protina na may mga konserbatibong pagpapalit (R4178K), K4116R) ay nagpapanatili ng 60% at 80% ng kanilang aktibidad, na nagpapahiwatig na ang pagpapahinga ng mga paghihigpit sa kani-kanilang panig ang mga chain ay sensitibo sa physicochemically (Larawan 3D).Ang pagpapalit ng ilang iba pang conserved residues E4145A, D4273A, F4281A at D4283A ay hindi gaanong nakakapinsala, at ang nsp9 UMPylation ay katamtamang nababawasan.Ang mga katulad na resulta ay nakuha sa mga reaksyon ng nsp9 NMPylation na kinasasangkutan ng iba pang mga NTP (Figure 3D at SI appendix, Figure S3), na nagpapatunay na ang mga naobserbahang epekto sa mga tiyak na pagpapalit ng amino acid ay independiyente sa uri ng nucleotide co-substrate na ginamit.Susunod, sinubukan namin ang posibleng epekto ng mga pagpapalit ng nsp12 na ito sa pagtitiklop ng mga coronavirus sa kultura ng cell.Sa layuning ito, gumamit kami ng naaangkop na genetically engineered complementary DNA (cDNA) na mga template na na-clone sa recombinant vaccinia virus (23, 24) upang mag-transcribe ng 5 -7 na mga cell.Ang titration ng mga nakakahawang progeny ng virus na ginawa sa mga cell na ito ay nagpakita na ang karamihan sa mga mutant ng HCoV-229E NiRAN ay hindi magagawa (Larawan 3E).Ang isang pangkat ng mga hindi mabubuhay na viral mutants ay kinabibilangan ng mga alternatibong ipinakita upang maalis o makabuluhang bawasan ang aktibidad ng transferase sa vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ngunit may dalawa pang alternatibo (K4116R, E4145A) 80 % nakalaan?Ang kanilang aktibidad na in vitro NMPylation ay nagmumungkahi na ang mga karagdagang paghihigpit ay kasangkot.Katulad nito, ang dalawang iba pang mutasyon (R4178K, F4281A) na nagdulot ng katamtamang pagbaba sa aktibidad ng in vitro NMPylation ng NiRAN ay gumawa ng mga live na virus, gayunpaman, ang mga virus na ito ay makabuluhang nagbawas ng mga titer sa pamamagitan ng pagtitiklop.Alinsunod sa data ng aktibidad na in vitro na ipinapakita sa Figure 3D, na pinapalitan ang apat na iba pang nalalabi na hindi natipid sa coronavirus at/o iba pang mga nested na virus (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ay gumawa ng mga mabubuhay na virus Ang mga supling, sa kabila ng pagkakaroon ng isang katamtamang nabawasan na titer kumpara sa wild-type na virus (Larawan 3E).
Upang mapag-aralan kung ang aktibidad ng paglipat ng NMP-mediated ng NiRAN ay nakasalalay sa aktibong domain ng RdRp, ang dalawang natipid na residue ng Asp na kasangkot sa koordinasyon ng mga divalent na metal ions (11) sa RdRp motif C ay pinalitan ng Ala. Ang nagresultang protina na nsp12_DD4823/4AA ay nagpapanatili ang aktibidad ng nsp9 NMPylation nito, na nagpapahiwatig na ang nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation na aktibidad ay hindi nangangailangan ng aktibidad ng polymerase (SI Appendix, Figure S4).
Matapos maitaguyod ang aktibidad ng paglipat ng NMP na tukoy sa nsp9 para sa nsp12, sinubukan naming kilalanin ang adduct ng NMP-nsp9 sa pamamagitan ng mass spectrometry (MS).Ang kumpletong spectrum ng masa ng protina ng recombinant HCoV-229E nsp9 ay nagpakita ng isang peak sa 12,045 Da (Larawan 4A).Ang pagdaragdag ng nsp12 ay hindi nagbago sa kalidad ng nsp9, na nagpapahiwatig na ang nsp12 at nsp9 ay hindi bubuo ng isang matatag na kumplikado sa ilalim ng mga kondisyon na ginamit (denaturasyon) (Larawan 4A).Sa pagkakaroon ng UTP at GTP, ang pagsukat ng masa ng reaksyon na naglalaman ng nsp9 at nsp12 ayon sa pagkakabanggit ay nagpakita na ang masa ng protina ng UTP ay lumipat ng 306 Da, at ang masa ng protina ng GTP ay lumipat ng 345 Da, na nagpapahiwatig na ang bawat molekula ng nsp9 ay nagbubuklod sa isang UMP o GMP (Larawan 4) C at D).Ipinapalagay na ang enerhiya na kinakailangan para sa NiRAN-mediated nsp9 NMPylation ay nagmumula sa NTP hydrolysis at pyrophosphate release.Kahit na ang isang 10-tiklop na molar na labis ng nsp9 (target) kaysa sa nsp12 (enzyme) ay ginamit sa reaksyong ito, halos kumpletong NMPylation ng nsp9 ay naobserbahan, na nagpapahiwatig na ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng nsp12 at nsp9 ay maikli ang buhay, at ang nsp12 ay maaaring NMPylate ng higit pang nsp9 sa vitro molekula.
Single NMPylation ng nsp9 sa pagkakaroon ng nsp12 at UTP o GTP.Ang ipinapakita ay ang deconvoluted complete protein mass spectrum ng HCoV-229E nsp9 (SI appendix, Table S1) (AD).(A) nsp9 lamang, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 sa pagkakaroon ng UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 sa presensya ng GTP.
Upang matukoy ang mga nalalabi ng nsp9 na UMPylated ng nsp12, ang nsp9-UMP ay nabura ng trypsin.Ang mga nagresultang peptides ay pinaghiwalay ng nano-high performance liquid chromatography (HPLC) at sinuri ng tandem mass spectrometry (MS/MS) online.Ang pagsusuri ng data gamit ang Byonic software package (Protein Metrics) ay nagpakita ng UMPylation ng N-terminal amino acid.Ito ay nakumpirma nang manu-mano.Ang tandem mass spectrum ng precursor peptide [UMP] NNEIMPGK (SI appendix, Figure S5A) ay nagsiwalat ng isang fragment sa 421 m/z, na nagpapahiwatig na ang UMP ay nagbubuklod sa residue 1 ng nsp9.
Sa N-terminus ng nsp9, ang Asn ay pinananatili sa mga miyembro ng Orthocoronavirinae (SI appendix, Figure S6).Bagama't naniniwala kami na ang N-terminal primary amine nitrogen ay ang pinaka-malamang na tumatanggap para sa UMP, nagpasya kaming kumuha ng karagdagang ebidensya ng NMP na nagbubuklod sa N-terminal.Para sa kadahilanang ito, ang non-NMPylated at NMPylated N-terminal peptide nsp9 na nalinis ng HPLC ay nagmula sa pagkakaroon ng acetone at sodium cyanoborohydride.Sa ilalim ng mga kundisyong ito, ang mga libreng pangunahing amin lamang ang maaaring mabago sa propyl (25).Ang N-terminal nsp9-derived peptide na may sequence na NNEIMPGK ay naglalaman ng dalawang pangunahing amine, isa sa N-terminus ng Asn at isa pa sa side chain ng Lys sa C-terminus.Samakatuwid, ang mga pangkat ng propyl ay maaaring ipakilala sa magkabilang dulo.Ang na-extract na ion chromatograms ng non-NMPylated peptides ay ipinapakita sa SI appendix, Figure S5B.Gaya ng inaasahan, maaaring matukoy ang N-terminal at C-terminal (mono)propylated (SI appendix, Figure S5B, upper lane) at dipropylated peptides (SI appendix, Figure S5B, lower lane).Nagbabago ang pattern na ito sa paggamit ng NMPylated N-terminal peptide ng nsp9.Sa kasong ito, ang C-terminal propylated peptides lamang ang maaaring makilala, ngunit ang N-terminal propylated peptides at dipropylated peptides ay hindi natukoy (SI Appendix, Figure S5C), na nagpapahiwatig na ang UMP ay inilipat sa N-terminal primary amine Upang maiwasan ito grupo mula sa paggawa ng mga pagbabago.
Susunod, papalitan namin (na may Ala o Ser) o tanggalin ang mga natirang nalalabi sa N-terminus ng nsp9 upang tukuyin ang mga limitasyong partikular sa target.Batay sa aming data ng MS na nagpapakita na ang NiRAN ay bumubuo ng isang nsp9-NMP adduct na may pangunahing amine ng N-terminal residue ng nsp9, na-hypothesize namin na ang nsp9 NMPylation ay nangangailangan ng viral master protease (Mpro, nsp5) upang palabasin ang nsp9 N-terminal mula sa polyprotein precursor nito.Para masubukan ang hypothesis na ito, gumawa kami ng precursor protein nsp7-11 na naglalaman ng nsp9 sa E. coli at nagsagawa ng standard na NMPylation test sa pagkakaroon ng [α-32P] UTP (mga materyales at pamamaraan).Tulad ng ipinapakita sa Figure 5A (lane 3), ang uncut nsp7-11 precursor ay hindi radiolabel na may nsp12.Sa kaibahan, kung ang nsp7-11 ay pinutol ng recombinant nsp5 upang palabasin ang nsp9 (at iba pang mga nsps) mula sa pasimula, ang isang radiolabeled na protina na lumilipat kasama ang nsp9 ay nakita, na nagpapatunay sa aming konklusyon na ang NiRAN at N- Selective formation ng covalent nsp9-NMP adducts .Ang terminal na pangunahing amine ng N-terminal na Asn (posisyon 3825 sa pp1a/pp1ab).Ang konklusyon na ito ay sinusuportahan din ng mga eksperimento gamit ang nsp9 construct, na naglalaman ng isa o dalawang karagdagang nalalabi sa N-terminus.Sa parehong mga kaso, ang NiRAN-mediated UMPylation ng nsp9 ay tinanggal (SI Appendix, Figure S7).Susunod, gumawa kami ng isang protina na may isa o dalawang nalalabi sa Asn na tinanggal mula sa pagkakasunud-sunod ng 3825-NNEIMPK-3832 peptide sa N-terminal ng nsp9.Sa parehong mga kaso, ang nsp9 UMPylation ay ganap na naharang (Larawan 5B), na nagbibigay ng karagdagang katibayan na ang tunay na nsp9 N-terminus ay kumikilos bilang isang receptor ng NMP.
Ang pagproseso ng proteolytic ng nsp9 at ang papel ng mga nalalabi sa N-terminal sa nsp12-mediated UMPylation.(A) nsp9 UMPylation ay nangangailangan ng isang libreng nsp9 N-terminal.Ang Nsp7-11-His6 ay pre-incubated sa 30 °C sa NMPylation detection buffer na naglalaman ng UTP sa presensya o kawalan ng recombinant na Mpro (nsp5-His6).Pagkatapos ng 3 oras, simulan ang NMPylation assay sa pamamagitan ng pagdaragdag ng nsp12-His6 gaya ng inilarawan sa Mga Materyales at Paraan.Ang reaksyon na naglalaman ng nsp5-His6 (lane 1) at nsp9-His6 (lane 2) ay ginamit bilang isang kontrol.Pagkatapos ng 10 minuto, natapos ang reaksyon at ang pinaghalong reaksyon ay pinaghiwalay ng SDS-PAGE.Ang protina ay nabahiran ng Coomassie Brilliant Blue (A, tuktok).Ang Nsp7-11-His6 precursor at ang naprosesong produkto na nagreresulta mula sa nsp5-His6 mediated cleavage ay ipinapakita sa kanan.Pakitandaan (dahil sa kanilang maliit na sukat) na ang nsp7 at nsp11-His6 ay hindi nakikita sa gel na ito, at ang reaksyon ay dinagdagan ng nsp5-His6 (lane 1 at 4; ang posisyon ng nsp5-His6 ay ipinahiwatig ng isang solidong bilog) o nsp9-His6 (Lane 2) ay naglalaman ng isang maliit na halaga ng MBP (ipinahiwatig ng mga bukas na bilog) bilang mga natitirang impurities dahil ang mga ito ay ipinahayag bilang mga MBP fusion protein (SI appendix, Table S1).(B) Ang variant ng Nsp9-His6 ay kulang ng isa o dalawang N-terminal Asn residues (residue numbering ayon sa posisyon sa pp1a/pp1ab) at dinadalisay at incubated ng nsp12-His6 at [α-32P] UTP.B, ang SDS-PAGE na may mantsa ng Coomassie ay ipinapakita sa itaas, B, ang kaukulang autoradiograph ay ipinapakita sa ibaba.Ang posisyon ng molecular weight marker (sa kilodaltons) ay ipinapakita sa kaliwa.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal conserved residues ay pinalitan ng Ala o Ser, at ang parehong halaga ng protina ay ginamit sa nsp12-His6 mediated UMPylation reaction.Ang mga produkto ng reaksyon ay pinaghiwalay ng SDS-PAGE at nabahiran ng Coomassie Brilliant Blue (C, tuktok), at ang radiolabeled nsp9-His6 ay nakita ng phosphorescence imaging (C, gitna).Gamit ang wild-type (wt) na protina bilang isang sanggunian (nakatakda sa 100%), ang kamag-anak na aktibidad ng NMPylation (mean ± SEM) ay kinakalkula mula sa tatlong independiyenteng mga eksperimento.(D) Ang mga titer ng virus sa p1 cell culture supernatant ng Huh-7 cells na nahawaan ng HCoV-229E wild-type na Huh-7 cells, at ang mga mutant na nagdadala ng mga itinalagang amino acid substitutions sa nsp9 ay tinutukoy ng plaque assay.Ang replication-deficient RdRp motif C double mutant DD4823/4AA ay ginamit bilang isang negatibong kontrol.
Ang N-terminus ng nsp9 (lalo na ang mga posisyon 1, 2, 3, at 6) ay napaka-conserved sa mga miyembro ng Orthocoronavirinae subfamily (SI appendix, Figure S6).Upang pag-aralan ang posibleng papel ng mga nalalabi na ito sa nsp12-mediated nsp9 NMPylation, dalawang magkasunod na nalalabi ng Asn sa N-terminus ng nsp9 ay pinalitan ng Ala o Ser (nag-iisa o pinagsama).Kung ikukumpara sa wild-type na nsp9, ang pagpapalit ng N3825 sa Ala o Ser ay nagresulta sa higit sa isang dalawang beses na pagbawas sa nsp12-mediated UMPylation (Larawan 5C).Alinsunod sa aming konklusyon na ang NMPylation ay nangyayari sa N-terminal primary amine sa halip na ang side chain ng N-terminal residue, napansin namin ang makabuluhang natitirang NMPylation kasama ang pagpapalit ng N3825A at N3825S.Kapansin-pansin, kung ang pangalawang Asn ay pinalitan ng Ala o Ser, ang nsp9 UMPylation ay nababawasan nang mas malakas (higit sa 10 beses), habang ang pagpapalit ng Ala sa mga posisyon 3, 4, at 6 ay may katamtamang epekto lamang sa nsp9 UMPylation (Larawan 2 ).5C).Ang mga katulad na resulta ay nakuha gamit ang ATP, CTP o GTP (SI appendix, Figure S8).Sama-sama, ang mga data na ito ay nagpapahiwatig ng pangunahing papel ng N2826 (posisyon 2 sa nsp9) sa nsp9 NMPylation.
Upang makakuha ng karagdagang katibayan ng functional correlation sa pagitan ng N-terminus ng nsp9 at NMPylation, nagsagawa kami ng multiple sequence alignment (MSA) ng nsp9 sequence ng pamilyang Coronavirus (nag-iiba-iba sa pagitan ng 104 at 113 na nalalabi) (SI Appendix, Figure S6).Sa kabuuan, sa 47 (kilala at putative) na species ng 5 genera ng Orthocoronavirinae subfamily na nakahahawa sa iba't ibang mammal, ibon, at reptile host, 8 nalalabi lamang sa kabuuan ang natagpuang invariant.Ang pinakamalawak na pagbabago, kabilang ang mga pagtanggal at pagsingit, ay naobserbahan sa mga pag-ikot sa pagitan ng mga elemento ng pangalawang istruktura ng nsp9, gaya ng tinutukoy ng mga nakaraang pag-aaral sa istruktura (26 ??28).Limang invariant residues ang natagpuan sa β strand at α helix ng C-terminal na bahagi ng nsp9.Tatlong invariant residues ang bumubuo sa NNE motif ng N terminus ng nsp9.Inihayag na ang pangalawang Asn ng motif na ito ay ang tanging invariant na nalalabi, na ibinabahagi rin ng hypothetical nsp9 ng malayong nauugnay na frog coronavirus, at kumakatawan sa Microhyla letovirus 1 species sa subfamily na Letovirinae ng Alphaletovirus.Ang pag-iingat ng mga nalalabi sa mga elemento ng pangalawang istruktura ng nsp9 ay maaaring mabigyang-katwiran ng mga pagsasaalang-alang sa istruktura upang mapanatili ang natitiklop o kilalang mga katangian ng pagbubuklod ng RNA.Gayunpaman, ang pangangatwiran na ito ay tila hindi nalalapat sa pag-iingat ng NNE, at bago ang pag-aaral na ito, ang likas na katangian ng mga hadlang na naglilimita sa pagkakaiba-iba ng pagkakasunud-sunod ng tripeptide ay ganap na natatakpan.
Para matukoy ang kahalagahan ng nsp9-NMPylation at NNE conservation sa coronavirus replication, gumawa kami ng HCoV-229E mutants, na nagdadala ng single o double substitution ng nsp9 N-terminal residues, na nagpapahiwatig na ang nsp9 NMPylation ay nakakapinsala sa vitro.Bago tayo magsimula, sinubukan naming sagutin ang tanong kung ang mga pagpapalit na ito (malapit sa nsp8 | 9 cleavage site) ay nakakaapekto sa pagproseso ng proteolytic ng rehiyon ng C-terminal pp1a.Isang set ng nsp7-11 polyprotein constructs na naglalaman ng kaukulang mga pamalit sa N-terminus ng nsp9 ay ginawa sa E. coli at pinutol gamit ang recombinant Mpro.Ang proteolytic cleavage ng apat na site (kabilang ang nsp9 flanking site) ay hindi gaanong naapektuhan ng anumang ipinakilala na mga pamalit (SI appendix, Figure S9), hindi kasama ang mga pagbabago sa istruktura sa mga protina na ito na nakakasagabal sa Mpro-mediated nsp8|9 cleavage ( O iba pa) website.
Ang mga cell ng Huh-7 ay inilipat na may genome-length HCoV-229E RNA, pag-encode ng Ala o Ser substitutions sa conserved NNE tripeptides (N3825, N3826, at E3827) sa nsp9 N terminus, na nagpapakita na ang karamihan sa mga mutasyon ay nakamamatay.Nailigtas namin ang virus sa pamamagitan ng pagpapalit ng Ser o Ala ng N-terminal na Asn (N2835A o N2835S), ngunit nabigong mabawi ang virus kasama ng iba pang single at double mutations sa NNE sequence (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Larawan 5D).
Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang pagtitiklop ng mga coronavirus sa tissue culture ay pinaghihigpitan (pareho o katulad), nililimitahan ang natural na mutation ng mga nsp9 NMPylation site sa katawan, at pagsuporta sa pangunahing papel ng tugon na ito sa siklo ng buhay ng mga coronavirus.
Sa huling hanay ng mga eksperimento, gumawa kami ng C-terminal His6 na may label na SARS-CoV-2 nsp12 at nsp9, at dalawang mutant na anyo ng nsp12 sa E. coli.Ang mga aktibong nalalabi sa site sa mga domain ng NiRAN at RdRp ay ayon sa pagkakabanggit Gumamit ng Ala sa halip (Larawan 6A at SI appendix, Talahanayan S2).Ang K4465 sa SARS-CoV-2 nsp12 ay tumutugma sa K4135 sa HCoV-229E (SI Appendix, Figure S2), na napatunayang kinakailangan para sa aktibidad ng NiRAN at pagtitiklop ng HCoV-229E (Figure 3D at E).Ang nalalabi na ito ay tumutugma din sa nalalabi ng arterial virus EAV nsp9 K94, na dati nang ipinakita na kinakailangan para sa NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16).Gaya ng ipinapakita sa Figure 6B, ang SARS-CoV-2 nsp12 ay may UMP transferase activity gamit ang nsp9 bilang substrate, habang ang nsp12_K4465A active site mutant ay hindi aktibo.Ang dobleng pagpapalit sa SDD na pagkakasunud-sunod ng katangian ng RdRp motif C ay hindi nakakaapekto sa aktibidad ng UMP transferase (Larawan 6B), na nagpapahiwatig na ang aktibidad ng RdRp ay walang direktang epekto sa nsp9 UMPylation.Ang magkatulad na data ay nakuha gamit ang CTP, GTP at ATP (SI appendix, Figure S10).Sa buod, ang data na ito ay nagpapahiwatig na ang NiRAN-mediated nsp9 NMPylation ay may konserbatibong aktibidad sa mga coronavirus na kumakatawan sa iba't ibang genera ng orthocoronavirus subfamily.
SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation ng nsp9.(A) Coomassie stained SDS-polyacrylamide gel na nagpapakita ng recombinant protein na ginamit sa NMPylation test.Bilang isang kontrol, ginamit ang isang mutant protein na may aktibong site substitution sa NiRAN domain (K4465A) at RdRp domain (DD5152/3AA) ng SARS-CoV-2 nsp12.Ang pag-numero ng nalalabi ay batay sa posisyon sa pp1ab.(B) Autoradiograph ng UMPylation detection gamit ang nsp9-His6 at [α-32P]UTP bilang substrate ng nsp12-His6 (wild type [wt] at mutant).Ang molecular mass (sa kilodaltons) ng may label na protina ay ipinapakita sa kaliwa.
Ang mga domain ng NiRAN ay karaniwang pinananatili sa Nidovirales (16), na nagpapahiwatig na pinapagana nila ang mga reaksyong enzymatic na mahalaga para sa pagtitiklop ng Nidovirus.Sa pag-aaral na ito, napatunayan namin na ang NiRAN domain ng coronavirus ay naglilipat ng NMP (binuo mula sa NTP) sa nsp9, isang misteryosong RNA binding protein na kasangkot sa pagtitiklop ng virus (26 ?? 29 ), upang matukoy ito bilang isang natural na target at kasosyo ng coronavirus RTC.
Ang domain ng NiRAN ay nagbabahagi ng tatlong sequence motif (AN, BN, at CN), na naglalaman ng napakaliit na bilang ng mga nalalabi na naka-conserve sa lahat ng pamilya sa monophyletic ngunit lubos na naiibang Nidovirales order (8, 16).Ipinakita ng mga kamakailang pag-aaral na ang mga ito ay may kaugnayan sa istruktura sa isang higit na hindi nailalarawan na pamilya ng mga protina na tulad ng protina kinase, na orihinal na tinawag na pamilyang SelO (17, 19, 22, 30, 31).Ang mga protina na nauugnay sa SelO ay may mga kinase folds, ngunit kulang ng ilang natipid na aktibong residue ng site sa mga klasikal na kinase (22, 32).Batay sa reverse orientation ng mga molekula ng ATP na nakagapos sa aktibong site at pinatatag ng mga tiyak na pakikipag-ugnayan, ang SelO ay na-hypothesize at kasunod na nakumpirma na ilipat ang AMP (sa halip na pospeyt) sa substrate ng protina (22), habang ang isa pang bacterial SelO-tulad ng protina na YdiU ay may kamakailan ay ipinakita upang ma-catalyze ang covalent attachment ng UMP sa Tyr at Kanyang mga nalalabi ng iba't ibang mga substrate ng protina (33).
Upang kumpirmahin at palawakin ang hula ng putative active site residues ng coronavirus NiRAN domain, ginamit namin ang biochemical at reverse genetics na pamamaraan para magsagawa ng mutation analysis sa coronavirus nsp12 (Figure 3D at E at SI appendix, Figure S3 at table) S1â S4).Ipinapakita ng data na ang pagpapalit ng HCoV-229E K4135, R4178 at D4280 na may Ala ay nag-aalis ng in vitro NMP transferase na aktibidad at pagtitiklop ng virus sa cell culture (Figure 3D at E at SI appendice, Figure S3), na sumusuporta sa kanilang presensya sa NTP γ-phosphate. ( K4135, R4178) at ang koordinasyon ng mga aktibong site na metal ions (D4280).Ang E4145A substitution ng conserved Glu sa hanay ng bird's nest virus na hinulaang magpapatatag sa K4135 (17) na posisyon ay ipinakita upang maalis ang viral replication, ngunit nakakagulat, ang aktibidad ay napanatili sa in vitro NMPylation assay (Figure 3D at E at SI appendix, Figure S3 At Mga Talahanayan S1–S4).Ang isang katulad na obserbasyon ay ginawa kapag ang kaukulang pagpapalit ay ipinakilala sa YdiU homolog ng Salmonella typhimurium (E130A) (33).Kung pagsasama-samahin, sinusuportahan ng data na ito ang pagpapaandar ng regulasyon ng natitipid na residue na ito sa halip na ang catalytic function.
Ang pagpapalit sa natirang Phe residue (F4281A) sa loob ng hanay ng nestovirus sa HCoV-229E NiRAN domain (8) ay nagresulta sa pagbaba sa aktibidad ng NMPylation sa vitro at isang makabuluhang pagbaba sa pagtitiklop ng virus sa cell culture (Figure 3D, E at SI) apendiks, Larawan S3).Ang data ay pare-pareho sa mahalagang regulatory function ng residue na ito, tulad ng homologous DFG motif Phe residue na ipinakita dati.Sa classical protein kinases, ito ay bahagi ng Mg2+ binding loop at tumutulong upang tipunin at ayusin ang gulugod???Kinakailangan para sa epektibong aktibidad ng catalytic (32, 34).Ang pagpapalit ng Ala at Arg para sa mga residue ng K4116 (sa preAN motif), ayon sa pagkakabanggit, ay inalis ang pagtitiklop ng viral at, gaya ng inaasahan, ay nagkaroon ng iba't ibang epekto sa aktibidad ng NMP transferase sa vitro, depende sa amino acid side chain na ipinakilala (Figure 3D At E at SI appendice , Larawan S3).Ang functional data ay pare-pareho sa impormasyon sa istruktura, na nagpapahiwatig na ang nalalabi na ito ay nagtatag ng isang pakikipag-ugnayan sa ATP phosphate (17).Sa NiRAN domain ng iba pang mga nested na pamilya ng virus, ang posisyon ng HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ay inookupahan ng Lys, Arg o His (8), na nagpapahiwatig na ang functional restriction ng partikular na residue na ito ay na-relax.Ang pagpapalit ng D4188A at D4283A ay nag-aalis o malakas na binabawasan ang aktibidad ng enzyme at inaalis ang pagtitiklop ng virus (Larawan 3).Ang dalawang residue na ito ay pinananatili sa karamihan (ngunit hindi lahat) ng mga nested na virus (8), na nagsasaad ng mahalagang function na partikular sa pamilya ngunit posibleng hindi catalytic.Ginamit bilang mga kontrol ang mga ala substitution ng ilang iba pang Lys at Asp residues (K4113A, D4180A, D4197A at D4273A) na hindi naka-conserve sa Coronaviridae o iba pang pamilya ng Nestioviridae (8).Tulad ng inaasahan, ang mga pagpapalit na ito ay higit na matitiis, na may bahagyang pagbaba sa aktibidad ng enzyme at pagtitiklop ng viral sa ilang mga kaso (Figure 3 at SI appendix, Figure S3).Sa pangkalahatan, ang data ng coronavirus mutagenesis ay lubos na pare-pareho sa self-GMP at reverse genetics data ng EAV NiRAN-RdRp (16), kung saan ang EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residue K94 (naaayon sa HCoV- 229E K4135) ay may mahahalagang function), R124 (naaayon sa R4178), D132 (naaayon sa D4188), D165 (naaayon sa D4280), F166 (naaayon sa F4281).Bilang karagdagan, ang data ng mutagenesis ng HCoV-229E ay pare-pareho at pinalawak mula sa naunang naiulat na SARS-CoV reverse genetics data (16), katulad na katulad sa mga naobserbahan para sa kaukulang CN motif na Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The phenotype na inilarawan -F219A at HCoV-229E_F4281A (Larawan 3 D at E at SI appendix, Larawan S3 at Talahanayan S1-S4).
Kung ikukumpara sa mga EAV orthologs (16), na may malinaw na kagustuhan para sa UTP at GTP (sa self-NMPylation reaction), ipinapakita ng aming pag-aaral na ang domain ng coronavirus NiRAN (kinakatawan ng HCoV-229E at SARS-CoV-2) ay maaaring maging epektibo. inilipat ang lahat ng apat na NMP, bagama't may kaunting kagustuhan para sa UMP (Mga Figure 1 at 3).Ang medyo mababang specificity ng partikular na NTP co-substrate ay pare-pareho sa kamakailang naiulat na SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomposite na istraktura, kung saan ang ADP-Mg2+ ay nagbubuklod sa aktibong site ng NiRAN, ngunit hindi sa adenine Part ng pagbuo ng mga tiyak na pakikipag-ugnayan (17).Sa aming pag-aaral, ang uri ng nucleotide na ginamit sa reaksyon ng NMPylation ay walang pagkakaiba-iba na epekto sa aktibidad ng mutant protein (SI Appendix, Figure S3), na nagpapahiwatig na wala sa mga nalalabi na ito ang malapit na nauugnay sa pagbubuklod ng isang tiyak na nucleobase.Ang batayan ng istruktura at potensyal na biological na kahalagahan ng iba't ibang mga kagustuhan sa co-substrate ng NTP na naobserbahan sa mga domain ng NiRAN ng mga coronavirus at arterial na virus ay nananatiling pag-aaralan;maaaring totoo ang mga ito o maaaring dahil sa limitasyon ng kani-kanilang pag-aaral.Sa kasalukuyan, hindi maitatanggi na ang potensyal na aktibidad ng NMPylator ng arterial virus na NiRAN domain (kumpara sa dating nailalarawan na aktibidad ng self-NMPylation) ay may ibang kagustuhan sa co-substrate, na isinasaalang-alang na ang pagkakatulad sa pagitan ng arterial at coronavirus. Ang NiRAN domain ay nasa limitasyon nito.Sequence-based Compare (16).Kung ikukumpara sa pseudokinase SelO, na gumagamit ng Mg2+ bilang isang cofactor, ang aktibidad ng coronavirus at arterial virus NiRAN ay nakasalalay sa Mn2+ (16) (Larawan 3C at SI appendix, Larawan S1).Ang pag-asa sa Mn2+ at halatang kagustuhan para sa UTP ay isang hindi pangkaraniwang katangian ng mga NMPylator ng protina, at kamakailan lamang ay nakumpirma sa YdiU protein ng Salmonella typhimurium, na nag-catalyze sa mahigpit na Mn2+-dependent na protein chaperone na UMPylation upang maprotektahan ang mga cell mula sa stress induction Cell ATP pool ( 33).
Ang kamakailang inilarawan na pagkakapareho sa istruktura sa pagitan ng coronavirus NiRAN domain at cellular protein kinases (17, 19) ay nagbibigay ng karagdagang suporta para sa kakayahan ng NiRAN na covalently link ng NMP sa iba pang mga protina na naiulat namin sa pag-aaral na ito.Itinuon namin ang aming paghahanap para sa posibleng mga target ng NiRAN sa mga protina na naka-encode ng HCoV-229E ORF1a, na kilala na direkta o hindi direktang tumutulong sa RTC's ORF1b-encoded replicase (12, 35).Ang aming mga eksperimento ay nagbibigay ng tiyak na ebidensya para sa epektibo at tiyak na NMPylation ng nsp9 (Larawan 2).Kung ang target na protina ay ginagamit sa isang molar excess na 8 hanggang 10 beses na mas mataas kaysa sa enzyme (nsp12), ito ay nakumpirma na ang nsp9 ay ganap na (mono)NMPized (Figure 4).Napagpasyahan namin na ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng nsp12 at nsp9 ay maikli ang buhay at hindi bubuo ng isang matatag na kumplikado na may nsp9 (sa kawalan ng iba pang mga subunit ng RTC).Ang konklusyong ito ay sinusuportahan ng mga pag-aaral ng pakikipag-ugnayan ng protina sa SARS-CoV proteome (35).Tinukoy ng pagsusuri ng MS ang pangunahing amine ng N-terminal residue ng nsp9 bilang site ng NMPylation (SI appendix, Figure S5).Ang pagbuo ng phosphoramidate bond at ang N-terminal amino group ay nakikilala ang NiRAN-mediated NMPylation na aktibidad mula sa Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation reaction, na nagpapagana sa pagbuo ng O-linked AMP sa Ser, Thr, o Tyr residues Peptide adduct ( 22), at ang S. typhimurium YdiU ay bumubuo ng O-linked (na may Tyr) at N-linked (kasama ang Kanyang) peptide-UMP addducts.Ang limitadong impormasyon na magagamit sa pamilya ng SelO ng mga protina ay nagpapahiwatig na ang mga miyembro ng malaking pamilya ng protina na ito ay naiiba nang malaki sa pagbuo ng mga peptide-NMP addducts.Ito ay isang kawili-wiling obserbasyon na nararapat sa karagdagang pag-aaral.
Ang data na nakuha sa pag-aaral na ito ay humantong sa amin sa hypothesize na ang NMPylation ng nsp9 ay nangangailangan ng isang libreng N-terminus.Sa konteksto ng viral replication, ito ay ibibigay ng proteolytic cleavage ng nsp8|nsp9 processing site sa replicase polyprotein pp1a na pinagsama ng Mpro at pp1ab.Sa karamihan ng mga coronavirus, ang pagkakaiba sa pagitan ng partikular na site na ito (VKLQ|NNEI sa HCoV-229E) at lahat ng iba pang mga coronavirus Mpro cleavage site ay Asn (sa halip na isa pang maliit na residue, tulad ng Ala, Ser Or Gly) ay sumasakop sa P1â???Lokasyon (36).Ang data ng cleavage ng peptide na nakuha sa mga unang pag-aaral ay nagpakita na ang kahusayan ng cleavage ng nsp8|nsp9 site ay mas mababa kaysa sa iba pang mga site, na nagpapahiwatig na 1) ang partikular na site na ito ay maaaring magkaroon ng isang regulatory role sa napapanahong coordinated processing ng C-terminal pp1a region, o 2) a Ang papel ng espesyal na conserved nsp9 N-terminus sa pagtitiklop ng virus (37).Ang aming data (Larawan 5A) ay nagpakita na ang recombinant na anyo ng nsp9 na nagdadala ng tunay na pagkakasunud-sunod ng N-terminal ay epektibong NMPized ng nsp12.Ang N-terminal flanking sequence ay inalis ng factor Xa (nsp9-His6; SI appendix, Table S1) o Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; Figure 5A at SI appendix, Table S1).Mahalaga, ang hindi pinutol na nsp9-containing precursor nsp7-11-His6 ay nagpakita ng paglaban sa NMPylation ng nsp12, na naaayon sa aming data, na nagpapahiwatig na ang nsp9-NMP adduct ay nabuo sa pamamagitan ng N-terminal primary amine (SI appendix, Figure S5) .Upang makakuha ng isang mas malalim na pag-unawa sa pagtutukoy ng substrate ng NiRAN, pagkatapos ay nakatuon kami sa katabing N-terminal na nalalabi ng nsp9.Sa kawalan ng iba pang mga protina, ang mga ito ay structurally flexible, na pumipigil sa kanila na makita sa unlabeled form ng nsp9 (26 28, 38), na nagpapahiwatig ng kanilang limitadong natural na pagkakaiba-iba Ito ay dahil sa mahalagang sequence-specific (hindi pangalawang istraktura na nauugnay) function ng nsp9 N-terminal fragment.Ang mga pagpapalit ng Ala ng mga natitipid na nalalabi sa rehiyong ito (Mga Figure 5C at D at SI appendix, Figure S8) ay nagpapakita na ang N3826 ay mahalaga para sa nsp9 NMPylation sa vitro, habang ang N3825A at E3827A na mga pagpapalit ay humahantong sa pagbaba sa M3829A at P3830A na mga pagpapalit. .Malinaw na nakakaapekto sa nsp9 NMPylation.Kahit na ang pagpapalit ng N-terminal Asn (N3825A, N3825S) ay may katamtamang epekto lamang sa nsp9 NMPylation at pagtitiklop ng virus sa cell culture (Larawan 5C at D), ang pagtanggal ng isang Asn residue sequence mula sa N-terminal 3825-NN dipeptide napatunayang Ito ay nakamamatay sa mga virus, na nagpapahiwatig na ang isang nalalabi ng Asn ay kinakailangan bago ang isa pang nalalabi sa N-terminus, mas mabuti ang Asn, bagaman tila ang pagpapalit ng mga katulad na nalalabi ay maaaring bahagyang disimulado (Larawan 5B, C, at D).Napagpasyahan namin na ang 3825-NN dipeptide, lalo na ang conserved at mahahalagang N3826 residue sa loob ng hanay ng coronavirus (SI appendix, Figure S6), ay nagsisiguro ng tamang pagbubuklod at oryentasyon ng nsp9 N-terminus sa aktibong site ng NiRAN.
Ang pagpapalit ng Ala (E3827A) para sa natipid na Glu ng lahat ng mga subfamilies ay nagpapanatili ng nsp9 NMPylation sa vitro ngunit nakamamatay sa mga virus sa cell culture (Figure 5C at D), na nagpapahiwatig ng karagdagang pag-andar ng residue na ito, halimbawa, sa mga pangunahing pakikipag-ugnayan (NMPylated o hindi binago. ) nsp9 N-terminus at iba pang mga salik na kasangkot sa pagtitiklop ng virus.Ang mga mutasyon ng Nsp9 ay hindi nakakaapekto sa proseso ng proteolytic ng nsp9 o anumang katabing nsps (39) (SI Appendix, Figure S9), na nagpapahiwatig na ang mga nakamamatay na phenotypes ng ilang mga mutasyon ng nsp9 na sinusunod ay hindi sanhi ng dysregulation ng C proteolytic process-terminal pp1a area. .
Ang data sa itaas ay nagbibigay ng ebidensya na pagkatapos ng Mpro-mediated na paggamot ng nsp8|9 cleavage site sa pp1a/pp1ab, ang N-terminus ng nsp9 ay maaaring i-UMPylated (o bahagyang mabago sa isa pang NMP).Bilang karagdagan, ang mahusay na pag-iingat ng N-terminus ng nsp9 (kabilang ang singular at invariant Asn residues sa pamilya ng coronavirus) at ang reverse genetics data na nakuha sa pag-aaral na ito (Figures 3E at 5D) ay humantong sa amin upang tapusin na ang inilarawan na nsp9 NMPylation ay may kaugnayan sa biyolohikal at mahalaga para sa pagtitiklop ng coronavirus.Ang mga functional na kahihinatnan ng pagbabagong ito ay nananatiling pag-aralan, halimbawa, tungkol sa naunang inilarawan (hindi tiyak) nsp9 (hindi binagong anyo) na aktibidad na nagbubuklod ng RNA (2628).Ang N-terminal NMPylation ay maaari ring makaapekto sa pakikipag-ugnayan ng nsp9 sa protina o RNA substrates o sa pagbuo ng iba't ibang apat na antas na pagtitipon.Ang mga ito ay naobserbahan sa mga pag-aaral sa istruktura at nakumpirma na may kaugnayan sa pagtitiklop ng coronavirus, bagama't lalo na sa kawalan ng Sa kaso ng pagbabagong ito (26- ââ29, 40).
Bagama't ang target na specificity ng coronavirus NiRAN domain ay kailangan pa ring ilarawan nang mas detalyado, ipinapakita ng aming data na ang protein target specificity ng coronavirus NiRAN domain ay napakakitid.Bagama't ang pag-iingat ng mga pangunahing aktibong residue ng site (8, 16) sa NiRAN domain ng lahat ng pamilya ng nidovirus ay malakas na sumusuporta sa aktibidad ng conserved NMPylator na mga protina na ito, ang pagkakakilanlan ng substrate binding pocket residues ng domain na ito Conservation and conservation ay nananatiling nailalarawan. , at maaaring magkaiba sa pagitan ng iba't ibang pamilya ng mga layunin ng Nidovirales.Katulad nito, ang mga nauugnay na target ng iba pang mga nested na virus ay hindi pa natutukoy.Ang mga ito ay maaaring malayong orthologs ng nsp9 o iba pang mga protina, dahil ang mga pagkakasunud-sunod sa labas ng limang replicase na domain na karaniwang naka-conserve sa mga nested na virus ay hindi gaanong natipid (8), kabilang ang genome array sa pagitan ng Mpro at NiRAN, Kabilang sa mga ito, ang nsp9 ay matatagpuan sa corona virus.
Bilang karagdagan, hindi namin kasalukuyang mabubukod ang posibilidad na ang NiRAN domain ay may karagdagang (kabilang ang cellular) na mga target.Sa kasong ito, ito ay nagkakahalaga ng pagbanggit na ang bacterial homologues sa umuusbong na protina na NMPylators (NMPylators) (30, 31) ay tila may "master regulators"?Ang NMP ay nagmo-modulate ng iba't ibang mga cellular protein upang makontrol o maalis ang kanilang mga aktibidad sa ibaba ng agos, sa gayon ay gumaganap ng isang papel sa iba't ibang mga biological na proseso, tulad ng pagtugon sa cellular stress at redox homeostasis (22, 33).
Sa pag-aaral na ito (Mga Figure 2 at 4 at SI Appendix, Mga Figure S3 at S5), napatunayan namin na inilipat ng nsp12 ang bahagi ng UMP (NMP) sa isang solong (conserved) na posisyon sa nsp9, habang ang iba pang mga protina ay hindi binago sa ginagamit Sa ilalim ng mga kundisyon, ang mahusay na tinukoy (sa halip na maluwag) na pagtitiyak ng substrate ay suportado.Alinsunod dito, kumpara sa N-terminal nsp9 NMPylation, ang sariling aktibidad ng NMPylation ng nsp12 ay napakababa, ang pagtuklas nito ay nangangailangan ng mas mahabang oras ng pagkakalantad ng autoradiography, at isang 10-tiklop na pagtaas sa konsentrasyon ng nsp12 ay ginagamit.Bilang karagdagan, ang aming pagsusuri sa MS ay nabigo na magbigay ng ebidensya para sa NMPylation ng nsp12, na nagmumungkahi na ang NiRAN domain self-NMPylation ay (sa pinakamahusay) isang pangalawang aktibidad.Gayunpaman, dapat tandaan na ang iba pang mga pag-aaral ay nagbigay ng paunang ebidensya na ang katayuan ng self-AMPylation ng bacterial NMPylator ay maaaring makontrol ang kanilang aktibidad na NMPylation sa iba pang mga substrate ng protina (22, 33).Samakatuwid, higit pang pananaliksik ang kailangan upang siyasatin ang mga posibleng functional effect ng self-NMPylation na aktibidad na iniulat para sa EAV nsp9 (16) at coronavirus nsp12 (pag-aaral na ito), kabilang ang iminungkahing chaperone-like effect sa pagtiklop ng C-terminal RdRp domain ( 16) ).
Noong nakaraan, ilang mga hypotheses tungkol sa mga posibleng downstream na pag-andar ng nidoviral NiRAN domain ay isinasaalang-alang, kabilang ang RNA ligase, RNA -capped guanylate transferase at aktibidad ng pag-priming ng protina (16), ngunit wala sa mga ito ang tugma sa magagamit na mga pag-andar sa ibaba ng agos.Ang impormasyong nakuha sa mga sumusunod na posisyon ay eksaktong parehong oras nang hindi gumagawa ng mga karagdagang pagpapalagay.Ang data na nakuha sa pag-aaral na ito ay pinaka-pare-pareho sa (ngunit hindi maaaring patunayan) na ang NiRAN domain ay kasangkot sa pagsisimula ng protina-sapilitan RNA synthesis.Dati ay pinaniniwalaan na ang pag-andar ng domain ng NiRAN sa 5??Ang ²-RNA capping o RNA ligation reactions ay hindi apektado ng mga ito at ng Suporta ng iba pang data.Samakatuwid, halimbawa, ang aktibong site ng NiRAN ay itinuturing na may kinalaman sa conserved na Asp bilang isang pangkalahatang base (D252 sa Pseudomonas syringae SelO; D4271 sa HCoV-229E pp1ab; D208 sa SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendix , figure 2 ).S2) (17, 22, 33), habang ang catalysis sa ATP-dependent na RNA ligase at RNA capping enzyme ay isinasagawa ng covalent enzyme-(lysyl-N)-NMP intermediate, na kinasasangkutan ng non-Change Lys residue ( 41).Bilang karagdagan, ang kahanga-hangang sequence-based na specificity ng coronavirus NiRAN para sa conserved protein target at ang relaxed specificity para sa NTP co-substrates (mas gusto ang UTP) ay sumasalungat sa NiRAN-mediated capping enzyme o RNA ligase-like functions.
Malinaw, maraming dagdag na trabaho ang kailangan para ma-verify at, kung mapapatunayan, ipaliwanag ang posibleng papel ng nsp9-UMP (nsp9-NMP) sa protina-induced RNA synthesis, na magkokonekta sa ilang kawili-wili ngunit (sa ngayon) ulat na naunang iniulat .Nakahiwalay na mga obserbasyon.Halimbawa, natukoy na ang dulo ng negatibong-strand na RNA ng coronavirus ay nagsisimula sa isang oligo(U) strand (42, 43).Ang pagmamasid na ito ay naaayon sa ideya na ang synthesis ng negatibong-strand na RNA ay sinimulan sa pamamagitan ng pagbubuklod ng UMPylated form ng nsp9 sa poly(A) tail ( triggers), na maaaring isulong ng RNA binding nito Ang aktibidad at/o pakikipag-ugnayan sa isa pang protina ng RTC.Ang bahagi ng UMP na ibinigay ng nsp9 ay maaaring gamitin bilang isang "primer" para sa nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation, gamit ang 3??²-poly(A) tail sa genomic RNA o Another oligo (A)-containing sequence nagsisilbing template, katulad ng mekanismong itinatag para sa picornavirus VPg protein (44).Paano kung ang panukala ay "non-normative"????Ang pagsisimula ng (protein-induced) negative-strand RNA synthesis ay nagbibigay ng link sa mga obserbasyon, na nagpapahiwatig na ang coronavirus negative-strand RNA ay may UMP (sa halip na UTP) sa dulo nito (42), na itinuturing na nagpapahiwatig na ang nucleic acid Dicer cleaves ang dulo phosphorylated sa pamamagitan ng isang hindi kilalang uridine-specific endonuclease.Kung nakumpirma, ang nucleic acid hydrolytic na aktibidad na ito ay maaaring makatulong na ilabas ang oligomeric UMPylated form ng nsp9 mula sa 5 ² dulo ng nascent negative strand.Ang posibleng papel ng nsp9 sa pag-priming ng protina ay pare-pareho din sa mga nakaraang pag-aaral ng reverse genetics, na nagpakita na ang nsp9 (at nsp8) ay kritikal na nakikipag-ugnayan at partikular sa conserved cis-acting RNA element malapit sa 3 dulo ng coronavirus genome.45).Ayon sa ulat na ito, ang mga nakaraang obserbasyon na ito ay maaari na ngayong muling suriin at palawakin sa pamamagitan ng karagdagang pananaliksik.
Sa buod, tinukoy ng aming data ang partikular na aktibidad ng isang proprietary nested virus enzyme tag na naka-link sa RdRp sa N-terminus.Sa coronavirus, ang bagong natuklasang NiRAN-mediated UMPylator/NMPylator na aktibidad na ito ay ginagamit upang umasa sa Mn2+ at katabing Asn residues at maging sanhi ng pagbuo ng (mababang enerhiya) na mga phosphoramidate bond sa N-terminal primary amine.Sa pamamagitan ng Mpro-mediated cleavage sa nsp8|9 cleavage site, ang target ng nsp9 ay maaaring gamitin para sa NMPylation, na nagpapahiwatig ng functional coupling sa pagitan ng protease at ng NiRAN domain, na umaabot sa RdRp.Ang pag-iingat ng mga pangunahing nalalabi sa aktibong site ng nsp12 NiRAN at ang target ng nsp9, kasama ng data na nakuha mula sa dalawang coronavirus kabilang ang SARS-CoV-2, ay nagbibigay ng matibay na katibayan na ang nsp9 NMPylation ay isang coronavirus Ang mga konserbatibong tampok ay isa ring mahalagang hakbang sa pagtitiklop ng virus.Ang magagamit na data ay humantong sa amin upang tapusin na ang partikular na papel ng NMPylated na anyo ng nsp9 sa protina-induced RNA synthesis ay isang makatwirang senaryo para sa coronavirus at iba pang mga nested na virus, at ang NiRAN ay maaari ring mag-target ng iba pang hindi natukoy na mga protina.I-regulate ang virus.Interaksyon ng host.Kung makumpirma, ang pagkakasangkot ng mga primer na protina sa viral RNA synthesis ay magpapataas ng pagkakaugnay ng pagkakasunud-sunod ng mga domain ng Mpro/3CLpro at RdRp sa pagitan ng dati nang natukoy na coronavirus at supergroup na tulad ng picornavirus (9), na pinag-isa na ngayon sa mga Pisonivirites kamakailan ( 46) sa kategorya.
Ipinapakita rin ng aming data na ang pangunahing, pumipili at konserbatibong aktibidad ng enzyme na natukoy sa pag-aaral na ito ay maaaring gamitin bilang mga target para sa mga antiviral na gamot.Ang mga compound na nakakasagabal sa pagbubuklod (at kasunod na pagbabago) ng conserved nsp9 N-terminus sa aktibong site ng NiRAN ay maaaring gawing epektibo at maraming nalalaman na antiviral na gamot, na angkop para sa paggamot ng mga coronavirus ng hayop at tao mula sa iba't ibang (sub)genus na Impeksyon , kabilang ang SARS-CoV-2 at Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus.
Ang coding sequence ng coronavirus protein na ginawa sa pag-aaral na ito ay pinalaki ng RT-PCR gamit ang RNA na nakahiwalay sa Huh-7 na nahawaan ng HCoV-229E o Vero E6 na nahawaan ng SARS-CoV-2, at ipinasok gamit ang mga karaniwang pamamaraan ng cloning.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) o pASK3-Ub-CHis6 (47) expression vector (SI Appendix, Tables S1 at S2).Ang mga solong pagpapalit ng codon ay ipinakilala ng PCR-based na site-directed mutagenesis (48).Upang makagawa ng MBP fusion protein, ang E. coli TB1 cells ay binago gamit ang naaangkop na pMAL-c2 plasmid construct (SI appendix, Table S1).Ang fusion protein ay nalinis ng amylose affinity chromatography at na-cleaved na may factor Xa.Kasunod nito, ang C-terminal His6-tag na protina ay nalinis ng Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) tulad ng naunang inilarawan (49).Para makagawa ng ubiquitin fusion protein, ginamit ng E. coli TB1 cells ang naaangkop na pASK3-Ub-CHis6 plasmid construct (SI Appendix, Tables S1 at S2) at pCGI plasmid DNA encoding ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Pagbabago (47).Ang C-terminal His6-tag na coronavirus protein ay nilinis gaya ng inilarawan dati (50).
Ang self-NMPylation test ng HCoV-229E nsp12-His6 ay isinagawa tulad ng inilarawan sa EAV nsp9 (16).Sa madaling salita, ang nsp12-His6 (0.5 µM) ay naglalaman ng 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol ( DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer ang tinukoy na NTP at 0.17 µM ay tumugma sa [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) sa 30 °C sa loob ng 30 minuto.Sa lahat ng iba pang (karaniwang) NMPylation assays ng nsp12-mediated nsp9 NMPylation, ang mga kondisyon ng reaksyon ay inaayos tulad ng sumusunod: nsp12-His6 (0.05 µM) at nsp9-His6 (4 µM) sa pagkakaroon ng 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM ang nagpahiwatig ng NTP, at 0.17 µM ang tumugma sa [α32-P]NTP.Pagkatapos ng incubating para sa 10 minuto sa 30 ° C, ang sample ng reaksyon ay hinaluan ng SDS-PAGE sample buffer: 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol at 0.005% bromophenol asul.Ang protina ay na-denatured sa pamamagitan ng pagpainit sa 90 ° C sa loob ng 5 minuto at pinaghiwalay ng 12% SDS-PAGE.Ang gel ay naayos at nabahiran ng Coomassie Brilliant Blue solution (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), na-decolorize, at naka-expose sa isang phosphorescent imaging screen sa loob ng 20 oras (upang makita ang nsp12 mula sa NMPylation) o (maximum) 2 Oras (upang masuri ang nsp9 NMPylation).Ginamit ang Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) para i-scan ang screen at ginamit ang ImageJ para pag-aralan ang intensity ng signal.
Para sa pagsusuri ng MS, ginamit ang 1 µM nsp12-His6 at 10 µM nsp9 (walang hexahistidine tag) sa pagsusuri ng NMPylation (SI appendix, Table S1) at ginamit ang tumaas na konsentrasyon ng 500 µM UTP at GTP.Depende sa kanilang konsentrasyon at inaasahang kalidad ng protina, ang Waters ACQUITY H-Class HPLC system na nilagyan ng MassPrep column (Waters) ay ginamit upang mag-desalt ng 1 hanggang 10 µL ng mga buffered protein solution online.Ang desalted protein ay na-eluted sa electrospray ion source ng Synapt G2Si mass spectrometer (Waters) sa pamamagitan ng sumusunod na gradient ng buffer A (tubig/0.05% formic acid) at buffer B (acetonitrile/0.045% formic acid), at ang temperatura ng column ay 60 ° C at isang flow rate na 0.1 mL/min: elution isocratically na may 5% A para sa 2 minuto, pagkatapos ay isang linear gradient sa 95% B sa loob ng 8 minuto, at panatilihin ang 95% B para sa isa pang 4 na minuto.
Ang mga positibong ion na may hanay ng masa na 500 hanggang 5000 m/z ay nakita.Ang Glu-fibrinopeptide B ay sinusukat bawat 45 segundo para sa awtomatikong mass drift correction.Gumamit ng software ng instrumento ng MassLynx na may extension ng MaxEnt1 para i-deconvolve ang average na spectrum pagkatapos ibawas ang baseline at smoothing.
Ang UMPylated HCoV-229E nsp9 ay hinukay sa pamamagitan ng pagdaragdag ng sequencing-grade modified trypsin (Serva) at incubated magdamag sa 37 °C.Isang Chromabond C18WP spin column (part number 730522; Macherey-Nagel) ang ginamit upang mag-desalt at mag-concentrate ng mga peptide.Sa wakas, ang peptide ay natunaw sa 25 µL ng tubig, na naglalaman ng 5% acetonitrile at 0.1% formic acid.
Ang mga sample ay sinuri ng MS gamit ang isang Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific).Ang ultimate nanoâ HPLC system (Dionex), nilagyan ng custom na end-mounted na 50 cm??75 μm C18 RP column na puno ng 2.4 μm magnetic beads (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Kumonekta sa mass spectrometer online sa pamamagitan ng Proxeon nanospray source;mag-iniksyon ng 6 µL ng trypsin digestion solution sa isang 300 µm inner diameter ×??1 cm C18 PepMap pre-concentration column (Thermo Scientific).Gamit ang tubig/0.05% formic acid bilang solvent, ang sample ay awtomatikong nakulong at na-desalinate sa isang flow rate na 6 µL/min.
Ang mga sumusunod na gradients ng tubig/0.05% formic acid (solvent A) at 80% acetonitrile/0.045% formic acid (solvent B) ay ginamit upang makamit ang paghihiwalay ng tryptic peptides sa rate ng daloy na 300 nL/min: 4% B para sa 5 minuto, pagkatapos ay 30 A linear gradient sa 45% B sa loob ng ilang minuto, at isang linear na pagtaas sa 95% solvent B sa loob ng 5 minuto.Ikonekta ang chromatographic column sa isang stainless steel nano-emitter (Proxeon), at direktang i-spray ang eluent sa heated capillary ng mass spectrometer gamit ang potensyal na 2,300 V. Ang survey scan na may resolution na 60,000 sa Orbitrap mass analyzer ay nauugnay. na may hindi bababa sa tatlong data na MS/MS scan, dynamic na hindi kasama sa loob ng 30 segundo, gamit ang linear ion trap collision induced dissociation o mas mataas na energy collision dissociation na sinamahan ng orbitrap detection , Ang resolution ay 7,500.
Oras ng post: Ago-03-2021